伯樂（Bio-Rad）垂直電泳槽（型號1658004，通常為Mini-PROTEAN Tetra系統組件）出現條帶分叉（單個預期條帶分裂為兩條，或呈“Y"形、雙峰狀），請按以下優先級排查處理。

一、蛋白質還原不充分（約占50%）

1、表現

（1）非還原狀態下，含二硫鍵的蛋白出現兩條帶（單體和二聚體/多聚體）。

（2）還原條件下，分叉條帶仍存在，尤其在高分子量區域。

2、處理

（1）增加還原劑濃度：上樣緩沖液中的DTT終濃度提高到100 mM（常規為50-100 mM），或β?巰基乙醇提高到5-5%。

（2）加熱變性：95-100℃加熱5-10分鐘，冷卻后再上樣。對難溶蛋白可延長至10-15分鐘。

（3）新鮮配制還原劑：DTT或β-ME易氧化，分裝凍存，避免反復凍融。

二、凝膠聚合不均勻（約占25%）

1、表現

（1）分叉出現在所有泳道的同一位置，且有時伴隨條帶彎曲或波浪形。

（2）重復制膠后分叉位置或程度變化。

2、處理

（1）充分混勻凝膠溶液：加入TEMED和APS后，渦旋震蕩10秒以上，立即灌膠。

（2）APS現配現用：10%過硫酸銨在4℃保存不超過1周，每次新鮮配制。

（3）避免氣泡：灌膠時動作輕柔，插入梳子時防止氣泡滯留在梳齒下方。

（4）控制聚合溫度：室溫太低（<20℃）可延長聚合時間，過高（>30℃）會導致聚合過快不均勻。

三、電泳條件不當（約占15%）

1、表現

（1）分叉在低電壓下減輕，高電壓下加重。

（2）同時伴有條帶拖尾或“微笑"現象。

2、處理

（1）降低電壓/電流：推薦濃縮膠80 V，分離膠120 V（恒壓）。或使用恒流（10-20 mA/板）。

（2）置于冰浴或冷室：過熱會導致凝膠局部變性速率差異，引起分叉。

（3）使用新鮮電泳緩沖液：舊的緩沖液pH漂移或SDS沉淀，可替換新液。

四、加樣孔或樣品雜質干擾（約占10%）

1、表現

（1）分叉僅出現在個別泳道。

（2）上樣孔內有不溶顆?；蛑悺?/span>

2、處理

（1）清洗加樣孔：拔梳后用1×電泳緩沖液沖洗每個孔，去除未聚合的丙烯酰胺碎片。

（2）樣品離心：上樣前12,000 rpm離心5分鐘，取上清，避免沉淀物堵塞孔底。

（3）避免高濃度去垢劑：樣品中SDS終濃度不宜超過2%。

五、蛋白自身修飾或降解

1、表現

（1）分叉條帶寬度與原條帶相似，且隨著儲存時間延長變得更明顯。

（2）使用新鮮制備的樣品分叉消失。

2、處理

（1）加入蛋白酶抑制劑（如PMSF、cOmplete™ cocktail）。

（2）分裝保存，避免反復凍融。

（3）檢查是否發生磷酸化、糖基化等修飾：如需確認，可用磷酸酶或去糖基化酶處理樣品看分叉是否合并。

六、快速診斷流程

1、跑一個強還原、新鮮變性的標準蛋白Marker（如預染Marker，已知無分叉）

結果：Marker也分叉

處理：凝膠或電泳系統問題：重新配膠、換緩沖液、降電壓

2、Marker正常，僅目的蛋白分叉

結果：樣品問題

處理：增加還原劑、加熱時間、離心上清

3、分叉僅出現在高分子量區域

結果：可能為二聚體或降解產物

處理：做非還原/還原對比；增加還原劑

4、更換另一臺電泳槽和電源

結果：分叉消失

處理：原設備電極絲或連接不良，需檢修

七、總結

先跑Marker——若Marker分叉，問題在凝膠或電泳條件（重配膠、降電壓、換新緩沖液）；若Marker正常，則樣品的還原或純度是主因（加大DTT、加熱、離心）。