處理小細(xì)胞（如PBMC、原代神經(jīng)元）漏計(jì)的問題，核心在于調(diào)整其基于深度學(xué)習(xí)的圖像識別參數(shù)，有時也需要更換更合適的檢測方法。

PBMC等細(xì)胞的直徑通常只有5-7微米，很容易被儀器誤判為碎片。下面的方案可以幫助您逐一排查，解決這個問題。

一、快速檢修路徑

您可以根據(jù)當(dāng)前情況，選擇適合的路徑進(jìn)行排查：

1、調(diào)整參數(shù) 

如果您剛完成計(jì)數(shù)并發(fā)現(xiàn)漏計(jì)，可以直接在結(jié)果界面點(diǎn)擊 Gating 進(jìn)行調(diào)整。

2、優(yōu)化樣本 (日常)

為了從源頭上減少漏判，請檢查并優(yōu)化細(xì)胞制備的每一個環(huán)節(jié)。

3、更換染料 (推薦)

如果臺盼藍(lán)結(jié)果一直不理想，可以嘗試切換到熒光染色（如AO/PI），它能獲得更精確的結(jié)果。

4、檢查維護(hù) (備選)

如果以上方法都無效，則需要檢查儀器的硬件清潔和軟件狀態(tài)。

二、方案A：優(yōu)化圖像識別參數(shù)（Gating）

這是解決漏計(jì)問題最直接有效的方法。Countess 3的AI計(jì)數(shù)依賴于預(yù)設(shè)的參數(shù)門限（Gating），優(yōu)化這些參數(shù)能讓儀器更精準(zhǔn)地識別小細(xì)胞。

1、進(jìn)入Gating界面：完成一次計(jì)數(shù)后，在結(jié)果（Results）屏幕上，點(diǎn)擊 Gating 按鈕。

2、調(diào)整參數(shù)滑塊：

（1）門限（起始點(diǎn)）：考慮到小細(xì)胞的特征，一個有效的起點(diǎn)是將尺寸（Size）、亮度（Brightness）和圓形度（Circularity） 的門限范圍調(diào)整到最大。對于Countess 3而言，這意味著將Size的上限滑塊拖動到最大值，例如70；將Brightness的上限滑塊拖動到255。這能確保捕獲所有細(xì)胞。

（2）活細(xì)胞/死細(xì)胞分別設(shè)門：軟件允許分別為活細(xì)胞和死細(xì)胞設(shè)置門限。確保它們的參數(shù)都已調(diào)整，特別是Size和Brightness的范圍要足夠?qū)挘园写?jì)數(shù)的對象。

（3）微調(diào)與觀察：調(diào)整后，觀察屏幕上細(xì)胞的圈選情況是否有改善。您可以根據(jù)實(shí)際情況，再逐步縮小范圍以排除非細(xì)胞信號。

3、保存為模板：參數(shù)優(yōu)化完畢后，一定要將其保存為一個新的自定義模板（Protocol）。這樣，下次處理同類樣本時就可以直接調(diào)用，確保結(jié)果的一致性和重復(fù)性。

三、方案B：改善樣本制備

高質(zhì)量的樣本是獲得準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)。

1、樣本純化：小細(xì)胞容易被碎片信號掩蓋。在計(jì)數(shù)前，盡量去除細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片）。可以使用密度梯度離心法等手段提純樣本。

2、確保單細(xì)胞懸液：成團(tuán)的細(xì)胞會增加識別難度，導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。務(wù)必通過輕柔吹打等方法確保細(xì)胞分散均勻，形成單細(xì)胞懸液。

四、方案C：切換到熒光檢測模式 (AO/PI雙染法)

1、如果反復(fù)調(diào)整參數(shù)后，臺盼藍(lán)染色的效果仍不理想，強(qiáng)烈建議您使用 Countess 3 FL 型號的熒光檢測功能。

2、熒光染色（如AO/PI法）對細(xì)胞的識別是基于DNA染色的，不易受細(xì)胞膜輕微變化或碎片干擾，因此特異性和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于臺盼藍(lán)，對PBMC這類小細(xì)胞尤其適用。有數(shù)據(jù)顯示，Countess 3 FL能有效完成對小鼠PBMC（可小至5μm）的熒光計(jì)數(shù)。

五、其他干擾因素

如果以上方法都未能解決問題，可以檢查以下外部因素：

1、細(xì)胞濃度和焦距：確保細(xì)胞濃度在1×10? 到 1×10?個細(xì)胞/毫升的范圍內(nèi)，并使用自動或手動對焦功能，確保畫面中的細(xì)胞邊緣清晰。

2、清潔與校準(zhǔn)：定期清潔儀器的鏡頭和載物臺；在操作前檢查是否已安裝新的軟件版本